研究簡介:研究了淹水稻田土壤中好氧-缺氧界面處甲烷氧化細菌（MOB）的分布和活性。甲烷是重要的溫室氣體，而MOB通過消耗甲烷減少其排放到大氣中。研究者利用微宇宙和冷凍切片技術，對土壤頂部3毫米進行了100微米級別的采樣，并使用pmoA基因作為功能和系統(tǒng)發(fā)育標記，通過t-RFLP、微陣列和克隆測序等方法分析了MOB群落結構和活性。研究發(fā)現，在好氧-缺氧界面附近，甲烷氧化活性最高，89%的總呼吸作用被限制在一個0.67毫米厚的區(qū)域內。與Methylobacter相關的OTU在這一區(qū)域非常活躍，每個細胞中pmoA轉錄本高達18個，表明它適應了微摩爾范圍內的氧和甲烷濃度。此外，與Methylosarcina相關的OTU與表層區(qū)域相關聯(lián)，該區(qū)域高氧但甲烷濃度僅為納摩爾級，表明這個OTU適應了貧營養(yǎng)條件。研究結果表明，不同的MOB OTU可以共享相同的微環(huán)境，并利用不同的生態(tài)位，這對于理解和管理甲烷排放具有重要意義。

Unisense微電極系統(tǒng)的應用

unisense氧氣微電極（型號OX50）被用來確定微環(huán)境中垂直氧氣分布情況。通過使用氧氣微電極，研究者能夠在微宇宙中精確測量氧氣濃度的垂直梯度，從而確定好氧-缺氧界面的精確位置。通過測量氧氣濃度的垂直分布，計算出土壤中氧氣的消耗率，從而能夠理解甲烷氧化過程對總呼吸作用的貢獻。

實驗結果

揭多樣的甲烷氧化菌群落中的有限子集是活躍的，而且大多數活動被限制在0.67毫米厚的區(qū)域。然而，我們的實驗顯示了單一群落中不同OTU如何共享相同的微環(huán)境，從而利用不同的生態(tài)位。我們假設活性在MOB根據底物可用性分隔的氧-厭氧界面處最高。這確實是事實，Methylobacter相關的OTU和總體甲烷氧化的主導位于氧-厭氧界面。這個OTU似乎很適應于氧-厭氧界面，在那里氧氣和可能是甲烷的濃度都在微摩爾范圍內。這個OTU在表層，其氧氣濃度高而甲烷濃度只有納摩爾范圍時是不活躍的。相反，Methylosarcina相關的OTU的轉錄本與表層層次相關，這表明其適應寡營養(yǎng)條件。

圖1、氧氣濃度和來源于pmoA基因及其轉錄本的垂直剖面。(a)用微電極測得的平均氧剖面。從圖中可以看出，氧濃度近似線性下降到深度約1.3毫米，然后在約1.8毫米深度之前，濃度呈明顯的彎曲達到零。(b)DNA和(c)RNA的pmoA tRF的相對豐度。tRF的系統(tǒng)發(fā)育從屬關系以及其大小用括號標明。rRNA：來自非特異性逆轉錄和擴增16S和23S rRNA序列的不同tRF的相對豐度的合并值；RPCs：稻田簇的相對豐度。

圖2、四個microcosms中基于DNA的群體結構的垂直分化。II型和Ia型MOB的平均相對豐度。II型對應于tRF 244；Ia型是所有其他片段的總和。與RT-PCR不同，DNA基礎的分析沒有遭受rRNA基因的非特異性擴增。

圖3、Methylobacter相關片段（tRF 508）的競爭性t-RFLP分析。顯示了pmoA基因拷貝數和pmoA RNA/DNA比率，帶有Sawitzky–Golay平滑器（n=5）。根據圖1a中顯示的微剖面使用Berg的程序PROFILE ver.1.0（Berg等人，1998年）計算了氧氣消耗速率，考慮了頂部2毫米。

圖4、轉錄模式的非度量多維標度（NMDS；Bray-Curtis相異性；應力?0.0689；R2=0.997；線性擬合，R2=0.989）通過pmoA微陣列雜交獲得的平均值；來自四個微環(huán)境。圖層顯示為黑色符號。綠色、紅色和藍色外殼分別顯示了三個不同的區(qū)域（表面，0–0.8 mm；缺氧-缺氧界面，0.8–2 mm和缺氧，2–3 mm）。區(qū)域之間的差異非常顯著（相似性分析，Bray-Curtis相異性，Po0.001）。紅色符號標記不同的探針。探針O_Mmb562對甲基藻具有特異性，將表面區(qū)域與其他兩個區(qū)域分開的。

結論與展望

好氧甲烷氧化細菌（MOB）使用有限的底物范圍，然而在一個稻田土壤中發(fā)現了430個物種等效的操作分類單元（OTUs）。這些OTUs如何在物理上共享它們的微生境尚不清楚。研究人員高度解析了MOB及其活性的垂直分布。使用microcosms和冷凍切片，在近原位條件下，在水飽和土壤的頂部3毫米中以100微米的步長進行了子采樣。使用顆粒態(tài)甲烷單加氧酶基因pmoA作為功能和系統(tǒng)發(fā)育標記，通過末端限制片段長度多態(tài)性（t-RFLP），pmoA特異性的診斷微陣列以及克隆和測序來評估群落結構和活性。通過競爭性逆轉錄PCR結合t-RFLP來定量pmoA基因和轉錄本。

只有甲烷氧化引起的可能令人滿意的總呼吸的89％限于氧-缺氧界面上方0.67毫米的厚度，這個界面可能由于甲烷氧化而引起。在這個區(qū)域，與甲烷濃度和氧氣濃度在微摩爾范圍內相關的一個與甲烷桿菌相關的OTU表現出極高的活性，每個細胞可達18個pmoA轉錄本，并且似乎適應于氧氣和甲烷濃度。使用pmoA特異的微陣列分析轉錄本發(fā)現與表面區(qū)相關的一個與甲烷球菌相關的OTU。表面的高氧氣體但只有納摩爾的甲烷濃度表明該OTU適應于寡營養(yǎng)條件。沒有發(fā)現II型甲烷氧化細菌（Methylosinus，Methylocystis）的轉錄本，這表明該組僅由休眠階段代表。因此，在單一行業(yè)內的不同OTUs共享相同的微環(huán)境并利用不同的生態(tài)位。Unisense的氧氣微電極技術為這項研究提供了一個強大的工具，使得研究者能夠在微觀尺度上精確測量氧氣濃度，這對于揭示甲烷氧化細菌在淹水稻田土壤中的生態(tài)位分配和活性具有重要意義。