研究簡介:口臭是牙周病的一種特征性癥狀，由硫酸鹽還原菌產生的揮發性硫化物(VSCs)引起，如硫化氫(H2S)和甲硫醇。重要的是在體外系統中，可培養的主要牙周機會性病原體牙齦卟啉單胞菌(Pg)、核酸棒狀桿菌(Fn)和連翹炭疽桿菌(Tf)通過氣相色譜法測量都會產生H2S。H2S不僅可以由細菌產生，也可以由宿主的代謝系統產生。然而，牙周細菌產生的H2S是否會影響牙周細菌周圍溶液中的H2S濃度，這一點尚不明確。H2S與心血管和神經系統的調節以及炎癥有關。它通過特定的酶（如CBS和CSE）自動產生，并可能與炎癥反應有關。牙齦上皮細胞是牙齦縫隙的第一道防線，對宿主的先天性和適應性免疫反應至關重要。它們通過產生促炎細胞因子和抗菌肽來保護宿主免受細菌挑戰。Pg和其他假定的牙周病原體不僅在病變的牙周袋中定植，也會在健康的牙齦縫隙中定植，但其對健康牙齦上皮細胞的影響尚未得到充分研究。研究推測牙周細菌產生的H2S可能通過上調牙齦上皮細胞產生的IL-8來促進炎癥反應。本研究的目的是監測不同口腔細菌菌株釋放的H2S濃度，并研究Pg釋放的H2S對牙齦上皮細胞產生的促炎細胞因子IL-8的影響。

Unisense硫化氫微電極與氫電極應用

細菌在肉湯培養基中培養至對數生長后期，然后調節所有菌株的濃度至光密度(OD 590nm)為0.9。然后，將細菌懸浮液在7000rpm轉速下離心15分鐘。上清液立即用針式H2S或H2電極(UnisenseA/S，丹麥)測量硫化氫(H2S)或氫氣(H2)。每次測試時，都要讓傳感器穩定下來，并以5秒鐘的間隔取三個測試點。在肉湯中培養的每種細菌菌株至少要分別進行三次H2S和H2的生成檢測。

實驗結果

IL-8介導的主要生物功能是對中性粒細胞(一種清道夫細胞)的化學吸引。中性粒細胞會遷移到上皮細胞釋放IL-8的部位，促進細菌的吞噬。一般來說，中性粒細胞釋放的活性氧(ROS)不僅能殺死細菌，還能加劇炎癥。H2S介導的上皮細胞IL-8上調應該會通過招募過多的中性粒細胞來增強該部位的炎癥。體內研究表明，內源性H2S和外源性H2S都有助于增加中性粒細胞向胰腺、肺和肝臟炎癥誘導區的遷移，這支持了我們的假設，即牙周細菌釋放的H2S也能促進中性粒細胞向牙周袋的趨化。首次證明了紅色復合牙周細菌Pg產生的H2S濃度能夠上調牙齦和口腔上皮細胞中誘導的IL-8表達，揭示了可能促進牙周疾病炎癥的機制。

圖1、測量口腔細菌釋放的H2S：在厭氧條件下培養屬于不同致病菌群復合體的14種細菌，直到它們達到對數生長后期。所有菌株的濃度均調整至0.9(以OD 590nm測量)。使用針式H2S或H2傳感器測量細菌培養液中的H2S和H2濃度。

圖2、外源H2S對OBA9和OKF6細胞IL-8產量的影響：將匯合培養的牙齦上皮細胞系(OBA9)或口腔上皮細胞系(OKF6)暴露于連續稀釋的H2S供體Na2S中24小時，無論是否有PMA(1μmolfL)刺激。用酶聯免疫吸附法測定OBA9(A)或OKF6(B)產生的培養上清中IL-8的濃度。

圖3、Pg W83釋放的可溶性因子(包括H2S)對OBA9和OKF6產生IL-8的影響：圖示為transwell檢測系統(A)。將上皮細胞OBA9或OKF6培養在下腔中，直至其完全覆蓋組織培養孔表面。隨后，將活體或固定的Pg W83與或不與H2S清除劑一起放入上腔。它們在含有炎癥刺激物PMA(1μmol/L)的KSF培養基中共同培養24小時。用酶聯免疫吸附法測定OBA9(B,D)或OKF6(C,E)培養上清中IL-8的濃度。

圖4、野生型Pg 33277或Pg KDP137(RGP-KGP-HagA三重缺失突變株)的對數生長期培養液使用針型H2S傳感器檢測H2S濃度。數據為三個培養物的平均值±SD。(B)OBA9細胞在下腔培養，Pg KDP137在有或沒有嗎啉樹脂的PMA(1mmol/L)存在下應用于transwell共培養系統的上腔。共培養48小時后，用ELISA法測定培養上清液中IL-8的濃度。

結論與展望

硫化氫(H2S)是一種揮發性硫化合物，被認為是導致炎癥的原因之一，尤其是由胃腸道器官中的細菌產生的硫化氫。然而，目前還不清楚牙周病原體產生的H2S是否會影響口腔/牙齦上皮細胞介導的炎癥反應。因此本論文研究的目的是比較14株口腔細菌體外產生H2S的情況；評估H2S對宿主口腔/牙齦上皮細胞誘導的炎癥反應的影響。Unisense微電極系統被用來精確測量口腔細菌在培養基中釋放的硫化氫（H2S）濃度。這種微電極能夠檢測溶解在溶液中的小氣體分子，包括H2S和氫氣（H2）。評估了不同細菌菌株產生的硫化氫量，從而識別出產生硫化氫最多的菌株，例如牙齦卟啉單胞菌（Pg）。通過unisense微電極系統測量硫化氫的濃度，研究人員能夠進一步研究硫化氫如何影響宿主細胞，特別是牙齦和口腔上皮細胞產生促炎細胞因子IL-8，從而揭示硫化氫在牙周病炎癥中的作用。牙齦卟啉單胞菌(Pg)在培養過程中產生的H2S最多，這反過來又促進了牙齦和口腔上皮細胞產生促炎細胞因子IL-8。IL-8表達的上調在外源性H2S的作用下得以重現。此外不產生主要可溶性毒力因子(即齦肽酶)的Pg突變菌株仍會產生H2S，并促進上皮細胞IL-8的產生，而H2S清除試劑則會抑制這種作用。這些結果表明，Pg產生的H2S濃度能夠上調牙齦和口腔上皮細胞中誘導的IL-8表達，揭示了可能促進牙周病炎癥的機制。Unisense微電極系統癌本研中它為研究人員提供了一種精確、可靠的方法來測量和分析口腔細菌產生的硫化氫，這對于理解硫化氫在牙周病中的作用機制至關重要。