帶給您多孔微電極陣列應(yīng)用案例分享

光遺傳學(xué)開辟了一個新的讓人激動的研究領(lǐng)域，使研究者可以在高時空分辨率下隨心所欲地控制某些特異類型的細(xì)胞。小編這期匯總了全球研究人員利用Maestro multiwell-MEA（多孔微電極陣列）系統(tǒng)配合光遺傳刺激（Lumos）系統(tǒng)進行相關(guān)研究的四個案例，幫助大家了解光遺傳學(xué)與MEA之間可以擦出什么樣的火花。

案例介紹

自主神經(jīng)系統(tǒng)：hiPSC衍生交感和副交感神經(jīng)元協(xié)調(diào)控制心率

來源：日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所細(xì)胞與分子生物技術(shù)研究部，2020，Scientific Reports

自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)通過去甲腎上腺素能交感神經(jīng)的興奮作用和膽堿能副交感神經(jīng)信號的抑制作用來調(diào)節(jié)組織的動態(tài)平衡和重塑。盡管有許多關(guān)于從人多能干細(xì)胞(hPSCs)誘導(dǎo)交感樣神經(jīng)元的報道，但還沒有一種誘導(dǎo)方法能有效地從hPSCs分化出膽堿能副交樣感神經(jīng)元。

本文研究者將傳統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法從2步修改為4步誘導(dǎo)出自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，誘導(dǎo)至36天時，在含有微型隧道的培養(yǎng)板上，可觀察到神經(jīng)元軸突的分化。在誘導(dǎo)52天后，給予表達ChR2的神經(jīng)元藍(lán)光刺激，跟隨光刺激的時程，在Maestro MEA系統(tǒng)上會檢測到相應(yīng)時程的神經(jīng)元放電，證明新方法誘導(dǎo)的神經(jīng)元已經(jīng)分化成為具有功能的ANS神經(jīng)元。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)，高細(xì)胞密度和低神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)ANS祖細(xì)胞分化成為交感樣神經(jīng)元，相反條件下可以誘導(dǎo)出副交感樣神經(jīng)元。為了檢驗這兩種ANS神經(jīng)元是否能對心肌細(xì)胞進行精確調(diào)控，研究者先將hiPSC來源的心肌細(xì)胞種植在Cytoview MEA 6孔板中，再將誘導(dǎo)至13天的交感樣和副交感樣神經(jīng)元分別與心肌細(xì)胞進行共同培養(yǎng)。

用藍(lán)光或尼古丁刺激表達ChR2的交感樣神經(jīng)細(xì)胞時，心肌搏動頻率顯著增加；而使用尼古丁刺激副交感樣神經(jīng)細(xì)胞時，搏動頻率明顯降低。單獨培養(yǎng)的心肌細(xì)胞使用尼古丁刺激時，只有微弱的變化。至此，研究者建立了一種從hPSCs中高度選擇性地誘導(dǎo)交感樣和副交感樣神經(jīng)元的方法，促進了人ANS神經(jīng)的建模和研究。

脊髓損傷：利用光遺傳學(xué)構(gòu)建斑馬魚脊髓損傷模型

來源：美國斯坦福大學(xué)，2017，SfN poster

復(fù)雜的脊椎動物神經(jīng)元的丟失往往伴隨著永久性的功能障礙，所以細(xì)胞消融成為潛在的建立脊髓損傷模型的有效方法?，F(xiàn)有的人工手刺法，具有極大的限制性——會引入外來損傷，并且重復(fù)性差、死亡率高。而光遺傳技術(shù)則可以更精確地控制特定細(xì)胞消融，模擬脊髓損傷。研究者將光敏感蛋白表達在斑馬魚的外周神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，使用藍(lán)光刺激誘導(dǎo)細(xì)胞消融后，在Maestro MEA系統(tǒng)中檢測神經(jīng)元放電狀態(tài)。

與傳統(tǒng)人工方法比較，兩種方法中網(wǎng)絡(luò)簇放電頻率都有不同程度的降低，而平均放電頻率都有不同程度的升高。這表明了利用光遺傳技術(shù)可以成功地建立脊髓損傷模型。該研究為神經(jīng)元環(huán)路的連通性與脊髓損傷病理學(xué)的探索提供了一種新的強有力的檢測方法。

用光控制收縮：在培養(yǎng)板上控制有功能的人類神經(jīng)-肌肉接點

來源：美國加州大學(xué)洛杉磯分校，2020，bioRxiv

研究者使用ALS病人來源的iPSC分化成的骨骼肌細(xì)胞和運動神經(jīng)元，建立了神經(jīng)肌肉接頭體外細(xì)胞模型。為了精確控制該細(xì)胞模型，他還將ChR2基因轉(zhuǎn)入運動神經(jīng)元內(nèi)表達，使用Lumos對樣本進行藍(lán)光刺激，并利用MEA系統(tǒng)記錄所得的電信號。

該結(jié)果顯示，藍(lán)光刺激可使神經(jīng)元產(chǎn)生同步放電，說明使用光遺傳學(xué)手段對神經(jīng)肌肉接頭進行精確控制是可行的。研究者分別使用神經(jīng)-肌肉接頭拮抗劑和特殊的多層共培養(yǎng)方法，均可確定記錄到的電活動是由神經(jīng)肌肉接頭產(chǎn)生的，而非運動神經(jīng)元所產(chǎn)生。最后，他將這種模型用于篩選能改善神經(jīng)肌肉聯(lián)接功能的潛在治療藥物。綜上所述，該體外細(xì)胞模型的建立，為包括ALS在內(nèi)的神經(jīng)肌肉疾病的研究和治療開辟了新方向。

神經(jīng)毒理：藥物促癲癇風(fēng)險評估的神經(jīng)毒理和藥理研究

來源：美國喬治亞理工學(xué)院

在體外功能性神經(jīng)毒理和藥物安全評估方面，嚙齒類動物原代神經(jīng)元和iPSC衍生神經(jīng)元已經(jīng)得到廣泛運用。但是在開展神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自發(fā)電活動測試時，相同樣本的不同復(fù)孔間或者不同來源的細(xì)胞間的定量結(jié)果可能會有差別，有些促癲癇物質(zhì)對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)放電的影響沒有被很好地體現(xiàn)出來。相比之下，誘發(fā)實驗使用可控刺激來獲得受控結(jié)果，有助于解決孔間一致性問題并加快實驗進展。另外，網(wǎng)絡(luò)活動的頻率和強度這兩個方面往往是關(guān)聯(lián)的。而使用光遺傳刺激就能夠通過控制頻率這個變量來將強度變量獨立出來。

因此，研究者設(shè)計了成對刺激實驗，獲得新的誘發(fā)檢測參數(shù)，可用于癲癇風(fēng)險評估相關(guān)的神經(jīng)毒理和藥理研究。最后，研究者還嘗試設(shè)計某種刺激模式來對應(yīng)生物學(xué)研究中的某個目標(biāo)，例如使用高頻刺激來模擬癲癇發(fā)作時的神經(jīng)活動。這一應(yīng)用凸顯了光遺傳刺激的意義。它在精準(zhǔn)控制設(shè)計上的靈活性，為開展神經(jīng)元功能及其機理研究等實驗提供了便利。