摘要

在本研究中，通過控制銅離子（Cu2+）濃度，可以顯著減少城市污水生物脫氮過程中氧化亞氮（N2O）的生成。首先，觀察到，當在厭氧-好氧（低溶解氧）BNR工藝中處理合成廢水時，添加Cu2+（10–100μg/L）可減少54.5–73.2%的N2O生成，并提高總氮去除率。然后，研究了Cu2+的作用。亞硝酸鹽和氧化亞氮還原酶的活性隨著Cu2+的加入而增加，這加速了亞硝酸鹽向一氧化氮（NO2）的生物還原?→NO）和一氧化二氮轉化為氮氣（N2O→N2）。定量實時聚合酶鏈反應分析表明，添加Cu2+增加了N2O還原反硝化菌的數量。進一步的研究表明，在添加Cu2+的系統中，更多的聚羥基烷酸酯被用于反硝化。最后，在處理實際城市廢水的另外兩種BNR工藝中，研究了通過控制Cu2+來減少N2O生成的可行性。由于城市污水中的Cu2+通常低于10μg/L，根據本研究，當BNR系統中的污泥濃度約為3200 mg/L時，將進水Cu2+補充到10–100μg/L有利于減少N2O排放并提高脫氮效果。

介紹

在許多國家，收集和處理的人類廢水數量正在增加，以維持和改善飲用水質量，以及其他公共衛生和環境保護效益。全世界都采用了經濟高效的生物脫氮（BNR）技術來去除排入當地水道的廢水中的營養物。然而，文獻數據表明，BNR過程可促進氧化亞氮（N2O）的生成，其變化范圍為氮負荷的0%至95%（Foley等人，2010年；Kampschreur等人，2008年；Meyer等人，2005年；Tallec等人，2006年；Zeng等人，2003年）。氧化亞氮（N2O）是一種有效的溫室氣體，其全球變暖潛力約為同等質量二氧化碳的300倍（Houghton等人，2001年），是過去250年來輻射強迫的第四大貢獻者（Stehfest和Bouwman，2006年）。此外，N2O是平流層NOx的主要來源，因此有助于催化臭氧破壞。Ravishankara等人（2009年）發現，N2O的臭氧消耗潛力與氟氯烴相似，預計在整個二十一世紀將保持最大。大氣中的N2O濃度從18世紀的約276 ppbv（Machida等人，1995）增加到2005年左右的320 ppbv（美國環境保護局，2011），這被證明是人為原因（Leuenberger和Siegenthaler，1992）。因此，廢水處理過程中脫氮除磷過程中N2O的生成不容忽視，需要探索減少N2O生成的途徑。

據報道，BNR過程中產生和排放N2O的來源有兩種：自養硝化和異養反硝化。（1）硝化作用主要由將銨轉化為亞硝酸鹽的銨氧化細菌（AOB）和將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽的亞硝酸鹽氧化細菌進行。當亞硝酸鹽在環境中積累時，AOB可以轉變為反硝化，最終產物主要是N2O而不是N2（Philips等人，2002年；Poth和Focht 1985年；Sliekers等人，2005年；Toyoda等人，2011年；Yang等人，2009年）。（2）由于N2O是異養反硝化的中間產物，不完全反硝化可能導致BNR過程中產生N2O（Otte等人，1996；Schalk-Otte等人，2000；Tallec等人，2008）。美國環境保護局（2009年）關于廢水處理作業產生的N2O源和匯的最新報告表明，缺氧區的反硝化作用是活性污泥反應器產生N2O的主要來源。還觀察到，反硝化過程中的N2O生成量為氮負荷的0.005–95%（Itokawa等人2001；Lemaire等人2006；Meyer等人2005；Tallec等人2008；Zeng等人2003），而硝化過程中的N2O生成量為氮負荷的0–16%（Burgess等人2002；Kampschreur等人2008；Tallec等人2006；Zheng和Hanaki 1994）。

迄今為止，文獻中已報告了幾種減少BNR中N2O生成的策略，例如增加缺氧時間或空氣補充，或應用分步進料序批式反應器（SBR）（胡等人，2011年；Kimochi 1998年；楊等人，2009年）。然而，當采用這些方法時，需要更大的反應堆體積、更大的功耗和額外的控制裝置。也有報道稱，在間歇曝氣活性污泥工藝中添加固定化糞產堿桿菌（反硝化菌）可降低N2O排放。然而，需要培養和制備固定化糞腸球菌（Park等人，2007年）。

眾所周知，反硝化途徑中N2O的還原是由一種覆銅蛋白——氧化亞氮還原酶（N2OR）催化的。通過低溫、高亞硝酸鹽、氧氣、H2S、低化學需氧量（COD/N）和固體保留時間（SRT）等抑制N2OR活性，將導致N2O累積（Hanaki等人1992；Itokawa等人2001；M?rkved等人2006；Noda等人2003；Otte等人1996；Schonharting等人1998；Zhou等人2008）。Granger和Ward（2003）指出，與鐵等其他金屬相比，銅是提高純反硝化菌N2OR活性的重要元素，導致反硝化過程中N2O積累顯著減少。Manconi等人（2006）觀察到，向反硝化污泥系統中添加銅可以消除H2S對N2OR的抑制作用。雖然銅是影響反硝化的一個已知因素，但銅對BNR工藝中減少N2O生成的影響尚未記錄。

本研究的目的是研究在厭氧-好氧（DO濃度0.15–0.5 mg/L）BNR過程中，Cu2+對N2O還原和養分去除的影響。從代謝中間產物、反硝化酶和反硝化菌群落三個方面研究了添加Cu2+減少N2O生成的機理。最后，在另外兩種BNR工藝中，研究了通過將Cu2+濃度控制在10–100μg/L來減少城市污水生物處理過程中N2O生成的方法。

材料和方法

合成廢水

厭氧-低溶解氧BNR工藝中使用的合成廢水每天制備，其中包含（每升）2.5 mL溶液A、2 mL溶液B、1 mL營養液、0.5 mL濃縮蛋白胨液和一定量的乙酸。溶液A含有（每升）10 g MgSO4?7H2O，4.5 g CaCl2?H2O和93.6 g NH4Cl。溶液B含有（每升）29 g KH2PO4和33 g K2HPO4。濃縮蛋白胨液每升含有200克蛋白胨。營養液中含有（每升）1.5 g FeCl3?6H2O，0.15 g H3BO3，0.03 g CuSO4?5H2O，0.18克碘化鉀，0.12克氯化錳?4H2O，0.06 g Na2Mo4?2H2O，0.12克硫酸鋅?7H2O，0.15 g氯化鈷?6H2O和10 g乙二胺四乙酸。用4 M HCl或4 M NaOH將合成廢水的初始pH調節至pH 7.4±0.2。

城市廢水

它是從中國上海一污水處理廠的初沉池出口獲得的。其主要特征如下：總COD 176–209 mg COD/L，可溶性COD（SCOD）140–170 mg/L，乙酸15–31 mg COD/L，氨（NH4+-N）19–30 mg/L，總氮（TN）28–38 mg/L，可溶性正磷酸鹽（SOP）2.8–4.8 mg/L，總磷酸鹽（TP）3.0–5.5 mg/L，pH 7.4–7.6。用溶液A和溶液B（如上所述）補充城市廢水，得到平均初始NH4+-N和SOP分別為30和12 mg/L。通過添加乙酸，反應器中的初始SCOD保持在約350 mg/L。用4 M HCl或4 M NaOH將城市廢水的初始pH值調整為pH 7.4±0.2。

Cu2+懸浮液的制備

本研究中使用了市售銅粉（Sigma），通過配備旋轉陽極和Cu-KR輻射源的Rigaku D/Max RB衍射儀進行X射線衍射分析，確認其為純銅（電子補充材料，圖S7）。為了制備1 g/L的Cu2+漿料懸浮液，將1.000 g銅粉（99.9%）分散到20 mL（1+1）硝酸中。將懸浮液加熱至銅粉溶解。然后添加10毫升（1+1）硫酸并加熱。冷卻后，將懸浮液充分混合在970 mL Milli-Q水中。

圖1不同Cu2+濃度下需氧階段N2O排放率（氣相）的比較

Cu2+對合成廢水厭氧-低溶解氧BNR過程中N2O生成的影響

六個厭氧-好氧序批式反應器（ALDSBR）每天運行三個周期，每個反應器的工作體積為4 L。每個循環8小時（2小時厭氧，3小時需氧，1小時沉淀，10分鐘傾析，110分鐘空閑）。種子污泥從中國上海市污水處理廠的二沉池中提取。該工廠采用BNR運行。在厭氧階段的最初10分鐘內，將合成廢水（2 L）泵入每個反應器。在低溶解氧階段，使用帶在線溶解氧檢測器的開/關控制系統間歇性提供空氣，以將溶解氧水平保持在0.15至0.5 mg/L之間。在低溶解氧階段結束前10分鐘，浪費污泥，以將SRT維持在約20天。沉淀后，從每個SBR中去除2 L上清液，產生16小時的水力停留時間。除沉淀、傾析和閑置期間外，反應器始終與磁力攪拌器混合。在培養開始時（即從第1天到第20天），這六個SBR中的COD、NH4+-N和SOP濃度分別控制在200、20和8 mg/L，然后從第21天到第40天逐漸增加到350、30和12 mg/L，并最終保持在這些濃度。培養126天后，觀察到所有反應器中的氮和磷去除率均未隨時間發生顯著變化，然后將Cu2+添加到反應器#1#5中，使其濃度分別為10、50、100、1000和5000μg/L。反應器#6作為對照，不添加額外的Cu2+。所有反應器均采用上述相同的厭氧-好氧配置運行。在所有SBR中氮磷去除和N2O生成相對穩定之前需要125天，然后報告數據。

在其他BNR工藝中通過控制城市污水處理過程中的Cu2+濃度來減少N2O生成的檢驗

運行了三個厭氧-好氧-缺氧SBR（AAA-SBR）和三個多厭氧（缺氧）-好氧SBR（MAAA-SBR），分別通過將Cu2+濃度控制在10和100μg/L來研究減少城市污水生物處理中N2O生成的可行性。從上述ALD-SBR#6中提取種子污泥。這六種SBR中的兩種，一種AAA-SBR和一種MAAA-SBR，不添加Cu2+，被設置為對照。所有SBR（每個SBR的工作體積為4.0升）每天運行三個周期（每個8小時）。厭氧-好氧-缺氧過程的每個循環包括2小時厭氧、2小時好氧、1小時缺氧、1小時沉淀、10分鐘傾析和110分鐘閑置。多厭氧（缺氧）-好氧過程的配置為100分鐘厭氧、60分鐘需氧、45分鐘缺氧、30分鐘需氧、45分鐘缺氧、30分鐘需氧、45分鐘缺氧和15分鐘需氧周期，然后是70分鐘沉降、10分鐘傾析和30分鐘空閑階段。沉淀期結束后，排出2.0升上清液，并在接下來的最初10分鐘厭氧時間內用2.0升新鮮城市廢水進行替換。這六個SBR保持在21±1°C，并通過在最終好氧階段結束前浪費污泥，將SRT控制在約20天。在活性污泥培養過程中，COD、NH4+和SOP的濃度分別保持在350、30和12 mg/L。直到在所有反應器中觀察到穩定的氮和磷去除，才報告數據。

分析方法

COD、NH4+-N、NO3的分析?-N、NO2號?-N、TN、SOP、TP、混合液體懸浮固體（MLSS）和混合液體揮發性懸浮固體（MLVSS）按照標準方法（美國公共衛生協會1998）進行。根據報告的方法測量糖原、聚羥基烷酸鹽（PHA）（包括聚羥基戊酸鹽、聚羥基丁酸鹽（PHB）和聚羥基-2-甲基戊酸鹽（PH2MV））（姜等人，2009）。使用微型傳感器（丹麥Unisense）測量氣相和液相中的N2O濃度，并根據報告的方法計算N2O排放率（Kampschreur等人，2008）。通過消耗電子受體（NO3）來測量硝酸鹽、亞硝酸鹽、一氧化氮和氧化亞氮還原酶的活性?,NO2號?,NO和N2O），芐基紫精作為合成電子供體（Krijansson和Hollocher 1980）。銅離子通過ICP-MS（安捷倫科技7700系列）檢測。

定量實時聚合酶鏈反應（PCR）如下所示。nosZ基因的引物分別為5′cGcracGcAAsgaaggtsmssgt3′和5′CAKRTG CAKSGCRTGGCAGAA3′，分別稱為nosZ2F和nosZ2R（Henry等人，2006）。5′ACCGCCGCCAA CAACTCCAAC3′和5′CCGCTGGCTTGAGC3′，分別稱為nirSsh2F和nirSsh4R，被用作nirS基因的引物（Henderson等人，2010）。nirK基因的引物為nirK876和nirK1040，其序列分別為5′atyggggvayggga3′和5′gcctcgatcagrttgt3′（Henry等人，2004）。它們的標準曲線（電子補充材料，圖S1、S2和S3）是使用分別含有nosZ、nirS和nirK序列的線性化質粒的10倍連續稀釋的三個重復序列作為模板，在上述文獻中描述的循環條件下生成的。通過觀察單個熔融峰（電子補充材料，圖S4、S5和S6）來檢查擴增產物的純度。使用從活性污泥中提取的基因組DNA，使用上述引物擴增nosZ、nirS和nirK基因片段，并在20μL體積中進行實時PCR分析，其中包含1μL 20×SYBR綠色PCR主混合物（SYBR（R）綠色I核酸a，Invitrogen），每個引物0.5μM，和1μL模板DNA。引物的熱循環條件符合上述文獻。然后，克隆nosZ、nirS和nirK基因片段，并通過測序進行驗證。根據提取質粒的濃度和大小（堿基對）計算含有nosZ、nirS和nirK的質粒的拷貝數。分別對活性污泥中的nosZ、nirS和nirK基因進行了獨立的定量PCR分析。對每個定量PCR分析運行兩個無模板對照。

表1 Cu2+對厭氧-低溶解氧BNR工藝處理的合成廢水中N2O生成和NH4+-N、TN和TP去除的影響

結果

Cu2+對厭氧-好氧（低DO）BNR工藝處理合成廢水過程中N2O生成和N、P去除的影響

據報道，一些氮被還原為N2O，而不是N2，從而在需氧期產生短暫的N2O累積。圖1顯示了六個SBR中有氧（低DO）期間N2O排放率的變化。SBR循環期間，生物反應器（#1–#4，#6）的N2O排放呈現出一種規律：N2O的排放速率在需氧期的前2.5小時增加，然后下降。

當Cu2+濃度為10μg/L和100μg/L時，N2O的最高排放速率分別為0.19和0.14μmol/min。與SBR對照（0.45μmol/min）相比，N2O排放率分別降低了58%和68%，表明在低劑量Cu2+添加（10–100μg/L）下，N2O排放量可以顯著減少。然而，當Cu2+濃度為5000μg/L時，觀察到N2O的釋放量較高，這表明Cu2+的劑量超過了適當的限制。在厭氧期間沒有檢測到N2O生成（數據未顯示）。

在本研究中，還測量了液體中的N2O生成量，并量化了總N2O（液相和氣相）。如表1所示，未添加Cu2+的反應器（即對照反應器）中的總N2O生成量為0.431 mg N2O-N/mg N。當Cu2+濃度為10μg/L時，N2O的生成量為0.196 mg N2O-N/mg N，當Cu2+濃度為100μg/L時，N2O的生成量進一步降低到0.119 mg N2O-N/mg N。然而，當Cu2+濃度增加到1000μg/L時，生成的N2O變為0.202 mg N2O-N/mg N。與對照組相比，進一步將Cu2+增加到5000μg/L會導致更高的N2O生成量（去除0.520 mg N2O-N/mg N）。因此，與對照相比，通過將廢水Cu2+濃度控制在10至100μg/L，可以減少54.4%至72.4%的N2O生成。

表1還顯示了Cu2+對NH4+-N、TN和TP去除的影響。當Cu2+濃度在10～100μg/L范圍內時，氨氮和總磷的去除率與對照組幾乎相同。然而，添加Cu2+對TN的去除有影響。對照組的TN去除率為60.6%，在10μg/L的Cu2+存在下增加到69%（p<0.05）。當Cu2+濃度在10到100μg/L之間時，TN去除率保持在70%左右。從表1還可以看出，NH4+-N和TN的去除率分別顯著降低到74.3%和36.3%，當Cu2+濃度增加到5000μg/L時，沒有凈磷去除。

圖2添加100μg/L Cu2+對NH4+-N和NO3變化的影響?-N（a）、硫酸鉀和二氧化氮?-N（b）在一個厭氧-低溶解氧循環中。誤差條表示三種不同測量的標準偏差